小鼠骨髓間充質干細胞（BMSC）分離自骨髓。在骨髓中，BMSC占骨髓有核細胞總數的0.001%-0.1%，含量極低。骨髓間充質干細胞的體外培養條件要求較高，在培養過程中，受貼壁時間、種植密度、血清含量、培養溫度和培養基pH值等條件的影響。
目前用于分離BMSCs的方法主要有五種，分別是貼壁篩選法、骨組織消化法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分離法。
密度梯度離心法是針對骨髓中不同細胞的大小和密度差異進行分選，骨髓細胞懸液加入到密度梯度離心液上面，通過離心使得不同類型細胞沉降至其等密度點，然后吸取特定位置富集的細胞。
常見的梯度離心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等，具有低粘性和低滲透性的特性，使用密度約為1.077g/mL。
在離心分層時，紅細胞及多核細胞因比重（1.080g/mL）較大而沉降于底部，其次是單個核細胞（包括BMSCs、造血干細胞、單核細胞等），懸浮密度位于（1.056~1.075）g/mL，血漿及其溶解物懸浮密度位于1.050g/mL。位于分離液之上的灰白色云霧狀層即為單個核細胞層，在獲取該層細胞后再通過差速貼壁法去除未貼壁細胞。
使用密度梯度離心法分離小鼠骨髓間充質干細胞效果好，但操作嚴格，不易掌握。
